阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:滴加3%1甲1醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。
預雜交:滴加預雜交液,37°C孵育1h。
雜交:傾去預雜交液,滴加含探針has-circ-ST6GALNAC6 probe 雜交液,濃度6ng/ul,恒溫箱37度雜交過夜。
雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。
滴加封閉液:滴加封閉血1清(正常兔血1清),室溫30min。
滴加鼠抗地1高辛標記過氧化物酶(anti-DIG-HRP):傾去封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min,后PBS洗3次×5min。
分子病理應用的檢測樣本主要包括石蠟組織、新鮮組織、脫落細胞、全血及其他體液等。石蠟切片標本厚度應在4-6μm,切片數(shù)量依據(jù)組織大小而定。樣本質(zhì)量對檢測結(jié)果和分析至關重要,病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷,并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理(例如含HCl脫鈣液處理),病變細胞(如細胞)的總量和比例,避免假陰性。進行NGS檢測前需通過病理診斷明確其的性質(zhì)及含量,根據(jù)不同類型選擇合適的基因panel測序。組織標本中細胞含量建議達到20%以上,低于此標準可富集后檢測。未經(jīng)病理評估的基因檢測結(jié)果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),擅長染色體原位雜交的公司,含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
原位雜交的預雜交:濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體,不洗。
雜交——按每張切片20μι雜交液,加在切片上。將原位雜交專1用蓋玻片的保護膜揭開后,蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
雜交后洗滌:揭掉蓋玻片,37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次;37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色,重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
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