基因法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞:
分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉(直徑為1 μm),加入滅菌蒸餾水制成金粉懸浮液,取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋蔥表皮的玻璃皿中,邊振蕩邊加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP質(zhì)粒,逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2,振蕩混勻?;騁DS-80轟擊時(shí)氦氣罐的氣壓為1 300 psi,取10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因中央,雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù),進(jìn)行轟擊,之后放置25℃避光過(guò)夜培養(yǎng),使用ConfocalLaser激光共聚焦顯微鏡觀察。
雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)是一種在生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)利用熒光標(biāo)記的兩個(gè)分子,通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理,檢測(cè)兩個(gè)分子之間的相互作用。下面將詳細(xì)介紹雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的原理、實(shí)驗(yàn)步驟、應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)。
雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的原理
雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)在一個(gè)緊密的空間內(nèi)相互靠近時(shí),一個(gè)熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光能量會(huì)被另一個(gè)基團(tuán)吸收,導(dǎo)致第二個(gè)基團(tuán)也發(fā)射熒光。這種熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移效率,可以推斷出兩個(gè)分子之間的距離和相互作用情況。
蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究方法
1、融合報(bào)告基因定位法
將綠色熒光蛋白(GFP)及其衍生蛋白、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)等報(bào)告基因,與目標(biāo)蛋白基因融合在一起,由目標(biāo)蛋白的引導(dǎo)信號(hào)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,對(duì)報(bào)告蛋白的光信號(hào)進(jìn)行跟蹤和觀察,從而確定目標(biāo)蛋白的定位。該方法是目前使用廣泛的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究方法。
2、熒光標(biāo)記定位法
將反應(yīng)與化學(xué)光學(xué)信號(hào)相結(jié)合,通過(guò)特異性的熒光標(biāo)記與目標(biāo)蛋白(抗原)結(jié)合,通過(guò)熒光信號(hào)檢測(cè),確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞位置。目前標(biāo)記信號(hào)不局限于熒光素,還有同位素、酶、膠體金顆粒、納米金屬顆粒等。
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